一百多年前，凯库勒梦见衔尾蛇，解开了苯环化学结构之谜；一百多年后，中国的化学家在纳米孔里复刻了同样的直觉，让一条线性蛋白质肽链首尾相扣，把最难读的生命信息，留在了最稳定的闭环里。

  近日，南京大学化学学院、生命分析化学全国重点实验室黄硕教授课题组在《自然》发表研究论文，提出一种“动态孔物成环”的全新机制，首次利用纳米孔实现了多肽序列的直接、高精度直读。

  蛋白质是生命功能的直接执行者。序列上一个氨基酸的微小替换，就可能会引起酶活性丧失、诱发阿尔茨海默症或恶性肿瘤。正因如此，为蛋白质测序，一直被视为解读生命密码的“皇冠课题”。

  与 DNA、RNA 测序近二十年的快速发展相比，蛋白质测序的研发进程一直步履缓慢，二者发展差距的核心症结在于能否实现分子扩增。

  核酸测序能快速普及，离不开聚合酶链式反应（PCR）技术。通俗来讲，PCR 就等于核酸的 “复印机”：科研人员只需获取微量 DNA 或 RNA 样本，就能在体外短时间复制出上百万份相同分子。充足的副本允许研究人员反复读取、校验信号，大幅度降低测序难度。

  一是质谱法：先把完整蛋白质切割成碎片，再通过一系列分析碎片信息反向拼接出完整序列。这种方法会破坏蛋白质原本完整结构，很难测出完整天然蛋白以及蛋白复合物。同时蛋白质都会存在糖基化、乙酰化等化学修饰，质谱技术很容易忽略或者误判这些关键信息。

  二是埃德曼降解法：从蛋白质一端依次剪下单个氨基酸逐一识别。但该方法对样品纯度要求极高，只要样品混杂多种蛋白，检测就难以进行。如果想要检测体液当中含量稀少、带有化学修饰的蛋白质，传统方法还需要经过多轮提纯、富集处理，不仅耗时很久，操作难度也很大。

  纳米孔测序被科学界视作破解蛋白质测序困境最有潜力的技术路线。纳米孔是一层薄膜上钻出的纳米级微小孔洞，在电场作用下，生物分子穿过小孔时会阻碍离子流动，形成独特的电流信号。不同氨基酸产生的信号各不相同，科学家通过识别电信号，就能破译分子序列。

  这套技术最大优点是单分子直接检测，不需要大量样品，也无需预先对分子做碎片化处理，理论上有望捕捉蛋白质完整信息、识别各类化学修饰。

  团队选用了具备天然八重对称漏斗结构的MspA纳米孔。黄硕告诉《中国科学报》：“你可以把 MspA 想象成一个八瓣拼接而成的固定漏斗。八重对称让整个漏斗结构结实稳固。漏斗最细的瓶颈很短，只有这里负责识别氨基酸，不同氨基酸经过瓶颈产生的电流差别一目了然。而且漏斗内壁可以精准‘加装挂钩’，把多肽拴在瓶颈位置，不让肽快速飘走。正是靠着这样的独特结构，才能实现一边酶切缩短肽链、一边依次读取氨基酸信息。”

  “读完之后的多肽游离在孔道外，就像放出笼子的小鸟，到处乱飞，很容易伪装成还没有被读过的序列，导致漏读、错读。”黄硕说。

  黄硕提到了有机化学史上那个著名的典故：19世纪，凯库勒为苯环结构苦思不得解，某天做梦，看见一条蛇咬住了自己的尾巴，首尾相连，幻化出一个闭合的环。受此启发，苯环的六元环状结构才得以确立。

  “大家突然意识到，我们也可以把多肽套进来，首尾连在孔道上。还在环上就是还没有读的，读完的可以直接切走了。”黄硕说。

  黄硕介绍，改造后的纳米孔内部设有两套各司其职的“挂钩”：一组是牢牢焊死的“固定挂钩”，拴住多肽的尾端，不让肽链飘走；另一组如同磁吸搭扣，能反复吸合、松开肽链前端。一固定、一吸附，肽链在孔道中临时围成圆环，研究人员称之为“动态孔物成环”。

  研究团队随后在孔道外引入了氨肽酶。肽链被牢牢“咬”在孔道里后，酶开始从氮端逐个切下氨基酸。每切掉一个，新暴露出的氮端便重新与接头结合一次，仪器便采集到一次干净的特征电流台阶。

  “以前是用核酸拉着蛋白质跑过去读，现在是‘蛇’咬住‘尾巴’，把自己挂在井口，切一刀、测一次。”黄硕打了个比方，“整个读取过程就像拍逐帧慢镜头，我们看着它一节一节变短，序列就自己吐出来了。”

  实验开始后，系统首先捕捉溶液中的目标多肽；随后依靠双挂钩结构完成锚定；当肽链头部吸附至感应区域时，仪器识别对应的电流信号，判断当前氨基酸种类；读取完成后，富集在纳米孔周边的氨肽酶精准切下肽链最前端单个氨基酸。肽链随之缩短一格，新的氨基酸暴露出来，检测流程再次循环。

  “通过‘捕’‘定’‘测’‘切’四个步骤，我们实现了纳米孔‘边切边测’并展示了多肽的直接序列测定。相比较数据分辨模糊的现有纳米孔多肽分析技术，我们的办法能够严格单向且以单氨基酸步长的读取方式对任何肽序列进行序列读取。”黄硕表示。

  “一旦该读取框架完成仪器端工程化，这项纳米孔肽段测序有关技术有望被应用于所有需要用蛋白质测序的应用场景中，如生命科学研究、疾病检测以及药物开发等。”

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